Obsesión (histología)

En los campos de histología, patología y biología celular, la obsesión es un proceso químico por el cual los tejidos biológicos se conservan del decaimiento, así previniendo la autolisis o la putrefacción. La obsesión termina cualquier reacción bioquímica en curso y también puede aumentar la fuerza mecánica o la estabilidad de los tejidos tratados.

Objetivos de obsesión

La obsesión del tejido se hace por varios motivos. Una razón es matar el tejido de modo que el decaimiento después de la muerte (autolisis y putrefacción) se prevenga.

La obsesión conserva una muestra del material biológico (tejido o células) como cerca de su estado natural como posible en el proceso de preparar el tejido para el examen. Para conseguir esto, varias condiciones por lo general se deben encontrar.

En primer lugar, un fijador por lo general actúa para incapacitar biomoléculas intrínsecas — en particular proteolytic enzimas — que por otra parte los resúmenes o dañan la muestra.

En segundo lugar, un fijador típicamente protege una muestra del daño extrínseco. Los fijadores son tóxicos a los microorganismos más comunes (bacterias en particular) que podría existir en una muestra del tejido o que podría colonizar por otra parte el tejido fijo. Además, muchos fijadores por medios químicos cambian el material fijo para hacerlo menos sabroso (indigesto o tóxico) a microorganismos oportunistas.

Finalmente, los fijadores a menudo cambian las células o tejidos en un nivel molecular para aumentar su fuerza mecánica o estabilidad. Esta fuerza aumentada y rigidez pueden ayudar a conservar la morfología (forma y estructura) de la muestra ya que se trata para el análisis adicional.

Incluso la obsesión más cuidadosa realmente cambia la muestra e introduce artefactos que pueden interferir con la interpretación de la ultraestructura celular. Un ejemplo prominente es mesosome bacteriano, que se pensó ser un organelle en bacterias gram positivas en los años 1970, pero fue mostrado más tarde por nuevas técnicas desarrolladas para la microscopia de electrones ser simplemente un artefacto de la obsesión química. La estandarización de la obsesión y otros procedimientos de procesamiento del tejido toma esta introducción de artefactos en cuenta, estableciendo lo que los procedimientos introducen que las clases de los artefactos. Los investigadores que saben que tipos de artefactos esperar con cada tipo del tejido y técnica de procesamiento pueden interpretar exactamente secciones con artefactos, o eligen técnicas que minimizan artefactos en áreas de interés.

Proceso de la obsesión

La obsesión es por lo general la primera etapa en un proceso multipaso para preparar una muestra del material biológico para la microscopia u otro análisis. Por lo tanto, la opción de fijador y protocolo de la obsesión puede depender de los pasos de procesamiento adicionales y análisis finales que se planean. Por ejemplo, el immunohistochemistry usa anticuerpos que ligan a un objetivo de la proteína específico. La obsesión prolongada puede enmascarar por medios químicos estos objetivos e impedir el anticuerpo ligar. En estos casos, un 'apuro rápido' método usando la formalina fría durante aproximadamente 24 horas típicamente se usa.

Tipos de obsesión

Hay generalmente tres tipos del proceso de la obsesión:

Obsesión de calor: Después de que una mancha ha secado en la temperatura ambiente, la diapositiva es agarrada por pinzas o una pinza y se pasa la llama de un Mechero Bunsen varias veces para calentarse - mata y adhiere el organismo a la diapositiva. Rutinariamente usado con bacterias y archaea. La obsesión de calor generalmente conserva morfología total, pero no estructuras internas.

El calor desnaturaliza la enzima proteolytic y prevenga la autolisis. La obsesión de calor no se puede usar en el método de la mancha capsular ya que la obsesión de calor encogerá o destruirá la cápsula (glycocalyx) y no se puede ver en manchas.

Perfusión: Obsesión vía flujo sanguíneo. El fijador se inyecta en el corazón con el volumen de inyección que corresponde a la salida cardíaca. Las extensiones adhesivas a través del cuerpo entero y el tejido no mueren hasta que se fije. Esto tiene la ventaja de conservar la morfología perfecta, pero las desventajas que el sujeto muere y el coste son altas (debido al volumen de fijador necesario para organismos más grandes)

Inmersión: La muestra de tejido se sumerge en el fijador del volumen a mínimo del 20 veces mayor que el volumen del tejido para fijarse. El fijador se debe difundir a través del tejido para fijar, por tanto la talla del tejido y la densidad, así como el tipo del fijador se deben considerar. La utilización de una muestra más grande significa que toma más largo para el fijador para alcanzar el tejido más profundo. Mejor en un vacío leve.

Obsesión química

En este proceso, las estructuras se conservan en un estado (tanto por medios químicos como estructuralmente) como cerca del tejido vivo como posibles. Esto requiere un fijador químico que puede estabilizar las proteínas, ácidos nucleicos y mucosubstances del tejido haciéndolos insolubles.

Tipos de fijadores químicos

Fijadores de Crosslinking - Aldehydes

Los fijadores de Crosslinking actúan creando covalent enlaces químicos entre proteínas en el tejido. Esto ancla proteínas solubles al cytoskeleton y presta la rigidez adicional al tejido.

Sin duda el fijador el más comúnmente usado en la histología es el formaldehído. Por lo general se usa como Neutral Buffered Formalin (NBF) del 10%, que es aprox. el 3.7 formaldehído del %-4.0% en la salina almacenada en un buffer del fosfato. Como el formaldehído es un gas en la temperatura ambiente, el gas de formaldehído de la formalina disuelto en el agua (el ~37% w/v) - se usa haciendo el antiguo fijador. El paraformaldehído es una forma de polymerised de formaldehído, por lo general obtenido como un polvo blanco fino, que depolymerises atrás a la formalina cuando calentado. El formaldehído fija el tejido por la unión de la cruz las proteínas, principalmente los residuos del aminoácido básico lysine. Sus efectos son reversibles por el exceso de agua y evita la pigmentación de la formalina. Otras ventajas incluyen: almacenaje a largo plazo y penetración del tejido buena. Es particularmente bueno para técnicas immunohistochemistry. También el vapor de formaldehído se puede usar como unos fijadores para manchas de la célula.

Otro aldehyde popular para la obsesión es glutaraldehyde. Funciona de un modo similar hacia el formaldehído causando la deformación de las estructuras de la hélice alfa en proteínas. Sin embargo el glutaraldehyde es una molécula más grande, y por tanto su precio de la difusión a través de membranas es más lento que el formaldehído. Por consiguiente la obsesión de glutaraldehyde en muestras del tejido más gruesas se puede obstaculizar, pero este problema se puede vencer reduciendo la talla de la muestra del tejido. Una de las ventajas de la obsesión glutaraldehyde es que puede ofrecer un más rígido o fuertemente unido fijado product—its la mayor longitud y dos grupos aldehyde permiten que ella 'tienda un puente' y una a pares más distantes de moléculas de la proteína. Causa cambios rápidos e irreversibles, apuros rápidamente, bien se satisface para la microscopia de electrones, apuros bien en 4C, y da el detalle citoplásmico y nuclear mejor total. Sin embargo no es ideal para la coloración de immunohistochemistry.

Algunos protocolos de la obsesión piden una combinación de formaldehído y glutaraldehyde de modo que su complemento de fuerzas respectivo el uno al otro.

Estos crosslinking fixatives–especially formaldehyde–tend para conservar la estructura secundaria de proteínas y pueden proteger cantidades significativas de la estructura terciaria también.

La precipitación de fijadores - Alcohols

Precipitando (o desnaturalizando) los fijadores actúan reduciendo la solubilidad de moléculas de la proteína y (a menudo) interrumpiendo las interacciones hydrophobic que dan a muchas proteínas su estructura terciaria. La precipitación y la agregación de proteínas son un proceso muy diferente del crosslinking que ocurre con los fijadores aldehyde.

Los fijadores de precipitación más comunes son el etanol y el metanol. Comúnmente son usados para fijar secciones congeladas y manchas. La acetona también se usa y se ha mostrado producir mejor histological la preservación que secciones congeladas cuando empleado en la Acetona Methylbenzoate Xylene (AMEX) técnica.

La proteína denaturants - metanol, etanol y acetona - raramente se usa sola para fijar bloques a menos que estudiar ácidos nucleicos.

El ácido acético es un denaturant que a veces se usa en la combinación con los otros fijadores de precipitación. Se conoce que los alcohols, por sí, causan el encogimiento considerable y el endurecimiento del tejido durante la obsesión mientras el ácido acético solo tiene que ver con el hinchazón del tejido; la combinación de los dos puede causar la mejor preservación de la morfología del tejido.

Oxidación de agentes

Los fijadores que se oxidan pueden reaccionar con varias cadenas del lado de proteínas y otras biomoléculas, permitiendo la formación de crosslinks que estabilizan la estructura del tejido. Sin embargo causan denaturation extenso a pesar de la conservación de la estructura de la célula fina y se usan principalmente como fijadores secundarios.

Osmium tetroxide a menudo se usa como un fijador secundario cuando las muestras están preparadas para la microscopia de electrones. (No se usa para la microscopía de luz ya que penetra secciones gruesas del tejido muy mal.)

Potasio dichromate, chromic ácido y permanganato del potasio todos encuentran el uso en ciertas preparaciones histological específicas.

Mercurials

Mercurials como b-5 y fijador de Zenker tienen un mecanismo desconocido que aumenta el resplandor que se mancha y dé el detalle nuclear excelente. A pesar de ser rápido, los mercurials penetran mal y producen el encogimiento del tejido. Su mejor aplicación es para la obsesión de hematopoietic y tejidos reticuloendothelial. También note que ya que contienen el cuidado de mercurio se debe tomar con la disposición.

Picrates

Picrates penetran el tejido bien para reaccionar con histones y proteínas básicas para formar picrates cristalino con aminoácidos y precipitar todas las proteínas. Es un fijador bueno para el tejido conjuntivo, conserva el glicógeno bien y extrae lípidos para dar resultados superiores al formaldehído en immunostaining de biogenic y hormonas del polipéptido sin Embargo, causa una pérdida de basophilia a menos que el espécimen a fondo se lave después de obsesión.

Fijador de la ESPERANZA

El Hepes-ácido-glutámico efecto de protección solvente orgánico mediado en el parachoques (ESPERANZA) da la morfología parecida a una formalina, la preservación excelente de antígenos de la proteína para immunohistochemistry y enzima histochemistry, ARN bueno y producciones del ADN y ausencia de proteínas crosslinking.

Secciones congeladas

Los chiringos del tejido (5×5×3 mm) se colocan en un medio de fijación cryoprotective — OCTUBRE, TBS, o Cryogel — entonces se rompen congelado en isopentane refrescado por el nitrógeno líquido. El tejido es entonces sectioned en un microtomo glacial o cryostat. Las secciones se fijan entonces en uno de los fijadores siguientes:

Acetona absoluta durante 10–15 minutos,

Etanol del 95% durante 10–15 minutos o

Acetona absoluta 10 minutos seguidos de etanol del 95% 10 minutos

Ventajas

Desventajas

Objetivo y fijador químico Do y Don'ts

~ Un picrate

Factores que afectan obsesión

pH

Se debería guardar en la variedad fisiológica, entre el pH 4-9. El pH para la preservación de la ultraestructura se debería almacenar en un buffer entre 7.2 a 7.4

Osmolarity

Las soluciones hipertónicas dan ocasión al encogimiento de la célula.

Las soluciones de Hypotonic causan el hinchazón de la célula y la obsesión pobre.

La formalina parachoques neutra del 10% es el formaldehído del 4% (1.33 osmolar) en el parachoques de PBS (0.3 osmolar) sumas a 1.63 osmolar. Esto es una solución muy hipertónica aún ha trabajado bien como una condición de la obsesión del tejido general durante muchos años en laboratorios de la patología.

Talla del espécimen

Grosor 1-4mm

Volumen del fijador

Al menos 15-20 veces mayor que volumen del tejido

Temperatura

El aumento de la temperatura aumenta la velocidad de la obsesión. Sin embargo, se requiere que el cuidado evite cocinar el espécimen. La obsesión rutinariamente se realiza en la temperatura ambiente.

Duración

Por regla general 1 hora por 1 mm

Tiempo de retiro a obsesión

La obsesión es un proceso químico, y el tiempo se debe permitir para el proceso completar. Aunque "sobre la obsesión" pueda ser perjudicial, bajo la obsesión se ha apreciado recientemente como un problema significativo y puede ser responsable de resultados inadecuados para algunos ensayos.

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